Cromatografia em coluna DICAS e TRUQUES para CROMATOGRAFIA de COLUNA:

Dicas e truques para o Lab: escolhas de Coluna

• Autor: Sarah Millar
• Data de Publicação: 03 Julho 2012
• Copyright: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Cromatografia em coluna DICAS e TRUQUES para CROMATOGRAFIA de COLUNA: torne-se um mestre desta técnica milenar com este GUIA ILUSTRADO! Como escolher o solvente, como empacotar a coluna, como escolher o material para a fase fixa e muito mais. 

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é uma técnica de purificação comumente usado em laboratórios de todo o mundo. Feito para a direita ele pode simplesmente e rapidamente isolar compostos desejados a partir de uma mistura. Mas, como muitos aspectos da química prática, a configuração rápida e eficiente e funcionamento de uma coluna é algo que pode levar anos para dominar. Aqui apresentamos algumas das dicas e truques do comércio para ajudar você a otimizar todos os parâmetros experimentais para obter a melhor separação de seus compostos.

As colunas são geralmente utilizados em laboratórios orgânicos e inorgânicos para remover material de partida que não reagiu ou isolar um produto desejado a partir de uma gama de subprodutos após uma reacção ter sido realizada. Para fazer isso, a amostra misturada é passado para baixo de um tubo de vidro vertical embalado com sílica ou alumina e recolhida em pequenas porções ou fracções, no final. Os vários componentes da amostra são separados nos seus diferentes tipos de compostos através da interacção com o solvente ea sílica. Compostos polares irá interagir com a sílica mais fortemente do que os não-polares, irá sair da coluna, ou elui, após não polares compostos. Quando uma amostra contém compostos com a polaridade semelhante, a separação entre o então pode ser pequeno e recuperar toda a sua amostra limpa pode se tornar um desafio.

Enquanto corretamente embalar sua coluna é sem dúvida o fator mais importante experimental, ainda há vários outros fatores que podem ser otimizadas para ajudar você a atingir a melhor separação possível no mais curto espaço de tempo. Aqui nós guiá-lo através de como escolher o melhor sistema de solventes para a sua amostra, e olhar para o quanto você vai precisar de sílica e em qual coluna tamanho.

Escolhendo um sistema de solvente

Esta é a escolha mais difíceis de fazer e os mais importantes. Em cada laboratório de química orgânica, há uma gama de solventes para escolher. Então, onde você começa?

A cromatografia em coluna, cromatografia flash em particular, é normalmente efectuada com uma mistura de dois solventes como a fase móvel: um polar, um não-polar. Ocasionalmente, um único solvente pode ser usado ou uma mistura de três solventes é necessária.

Muitas pessoas têm seus sistemas favoritos solventes e iniciará automaticamente com estes e ajustar a mistura, conforme necessário.Solventes comuns e sistemas de solventes são dadas na Tabela. 1.

Tabela 1. solventes comuns e sistemas de solventes para a coluna e cromatografia flash.

Para obter uma boa separação entre seu produto e todas as impurezas e, se possível, usar o mínimo possível de solvente, é a chave para testar potenciais sistemas de solventes antes de configurar a coluna. Para fazer isso, você precisará executar cromatografia em camada delgada (TLC), utilizando folhas de vidro ou alumínio revestidas com sílica (as folhas de alumínio são mais baratos, assim são os mais comuns).

Para executar um teste de TLC

Você vai precisar de:

TLC folha

Tesoura / Stanley cortador de faca / caixa

Lápis

Recipiente de vidro tal como um copo pequeno com relógio de vidro ou placa de petri como uma tampa

Solvente (s) a ser testado

Capilar TLC spotter ou micropipeta (ver: Como Fazer um capilar TLC Spotter )

Pinça

Lâmpada UV ou mergulho permanganato de potássio para visualizar

Método:

1. Cortar a folha de TLC em tiras de aproximadamente 2 cm x 7 cm.
2. Desenhar uma linha lápis no lado curto, aproximadamente 0,5 cm do fundo. Não usar a caneta como a tinta irá dissolver no solvente orgânico para fora e separada, obscurecendo ou contaminar os resultados.
3. Verter o solvente (s) a ser testado para o recipiente de vidro. O solvente deve ser 2-3 mm de profundidade de modo a que a amostra manchado e que a linha não estão submersos. Isso assegura que a amostra não se dissolve no solvente, subindo a placa de TLC com o solvente.
4. Use um removedor capilar ou micropipeta para "manchar" alguma da sua amostra para a linha: Toque no spotter ou pipeta para a placa de TLC de sílica suavemente e permitir ação capilar para tirar a amostra para baixo sobre o prato. É melhor para tocar o observador para os TLC 2-3 vezes por curtos períodos de tempo (> 1s) do que para mantê-la contra a placa por um longo tempo. A mancha resultante deve ser de 1-2 mm de diâmetro.
5. Suportar a tira de TLC no recipiente com o solvente (s).
6. Aguarde e verifique regularmente. Não se mova ou perturbar a placa ou o recipiente TLC isto pode causar ondulações no progresso solvente e irregular da frente do solvente acima da placa.
7. Quando a frente de solvente é 0,5-1 cm do topo da placa, cuidadosamente remover a placa a partir do recipiente, com uma pinça.
8. Permitir que o solvente sobre a placa para evaporar e, em seguida visualizar a placa usando uma lâmpada UV ou mergulho permanganato de potássio.
9. Marcar a lápis onde as manchas são como as cores intensas inicialmente a partir do mergulho permanganato pode desaparecer ao longo do tempo e é difícil de medir um manveuver R _f valor (ver abaixo), sob uma lâmpada UV.

Agora você pode determinar se os componentes de sua amostra separar no solvente selecionado. Se você receber separação pobres, escolher um outro sistema de solventes e tente novamente.

O que é uma boa separação? / O que eu estou procurando no meu TLC?

O resultado final deve ser um sistema de solvente que se move o composto alvo aproximadamente 1/3 do total do caminho solvente (R _fvalor entre 0,25 e 0,35, Fig. 1).

Figura 1. disposição típica placa de TLC e definição de R _f valor.

Um sistema de solvente que dá um R _f entre 0,25 e 0,35 é recomendado pois dá o tempo de amostra para equilibrar a coluna e, assim, ser completamente resolvidos em todas as suas partes componentes. Não fique tentado a usar um sistema de solvente com um maior R _f  - especialmente se este é o único sistema solvente de ter testado - como uma eluição rápida pode resultar em uma impureza que está sendo mascarado por um outro ponto (Fig. 2).

Figura 2. Escolha entre eluição rápida (esquerda) e faltando uma impureza escondida (à direita).

Embora seja possível para um ponto a ter um R _f que é demasiado elevado, o oposto também é verdadeiro se o composto desejado é um dos pontos mais tarde com eluição. Aqui, é possível para o local a ser demasiado lento (baixo R _f ). Fig. 3 mostra o local desejado praticamente não se move para fora da linha de base, enquanto as impurezas corrida à frente. Você pode ser tentado a usar esse sistema de solventes para evitar a contaminação potencial que vem com uma pior separação, mas um maior R _f para o seu produto. Isto normalmente provar ser um erro. Quanto mais tempo o composto passa na coluna, mais chance ele tem de inferiorizar e menos produto que você vai se recuperar. Tentar isolar um composto com um baixo R _f valor irá também ter um longo período de tempo e uma grande quantidade de solvente. Neste caso, é melhor para tentar uma separação ligeiramente Messier e usar mais de sílica (ver abaixo).

Figura 3. separação Limpo (esquerda) versus mais rápido de eluição (direita) quando o produto é o segundo lugar.

Quando você encontrar um sistema solvente que dá separação razoável, você deve tomar alguns momentos para olhar para a forma das manchas. Idealmente, as manchas devem ser redondas e distintas umas das outras (Fig. 4, um ). Spots com caudas longas em uma placa TLC pode se traduzir em faixas largas e, possivelmente, à sobreposição de compostos na coluna real. Se você já tentou vários sistemas de solventes e não pode encontrar um que dá pontos perfeitamente redondas, não se preocupe. Enquanto a separação entre os pontos é bom (Fig. 4, 2 ), será ainda obter uma boa separação na coluna. Na situação na Fig. 3. 4, é ainda possível obter uma amostra limpa do composto de topo, para a caracterização por exemplo, mas você vai perder alguns de seus produtos à medida que as caudas para a banda seguinte na coluna. Isto não é recomendado se o rendimento é importante.

Figura 4. formas ponto possível sobre uma placa de TLC.

Outros fatores a considerar ao escolher um sistema de solventes

Você vai encontrar algumas vezes que os sistemas de dois ou mais solventes dar separação adequada de seus compostos, ou você vai ver as pessoas correm de uma coluna com um sistema solvente que dá adequada, mas não é a melhor separação na placa de TLC. Então, o que afetou sua decisão?

Há dois outros fatores a considerar: preço e ponto de ebulição.

Preço

Se dois sistemas de solventes dar uma boa separação de forma semelhante, o mais barato dos solventes não-halogenados deve ser usado. Tipicamente, isso irá resultar em uma hexanos: mistura de acetato de etilo. Se você não tiver certeza do custo relativo de um solvente, uma boa regra é olhar para o tamanho do recipiente. Solventes mais baratos são geralmente adquiridos em quantidades maiores do que os seus homólogos mais caros.

É importante notar aqui que alguns hexanos baratos ou éteres de petróleo, especialmente aqueles em recipientes de plástico, muitas vezes contêm hidrocarbonetos saturados que são difíceis de remover e pode fazer a interpretação de espectros de RMN difícil, especialmente na faixa de 1-1,5 ppm. Nestes casos, o solvente pode ser destilado antes da utilização (demorado), ou pode usar um solvente melhor grau (mais caros).

Ponto de ebulição

O argumento para a escolha entre dois solventes com separação semelhante e diferentes pontos de ebulição é simples: sempre escolheu o solvente mais baixo de ebulição. Você vai salvar um monte de tempo e esforço a longo prazo como maior ponto de ebulição solventes vai demorar mais tempo para evaporar e requerem aquecimento ou pressão reduzida para remover quando você tenta recuperar o seu composto de solução.

Escolher o tamanho correto da coluna

Alguns argumentam que este é o fator menos importante quando a criação de uma coluna. Com efeito, em teoria, é possível utilizar uma coluna muito fina com um comprimento longo de sílica ou uma coluna de espessura com comprimento mais curto de sílica para efeito igual (Fig. 5).

Figura 5. Escolha do tamanho da coluna é menos importante do que a quantidade de sílica usado.

No entanto, na prática, a maioria das pessoas escolher um tamanho da coluna, que lhes permite encher coluna cerca de um-terço a metade cheio de sílica - não incluindo o reservatório de solvente (Fig. 6). Isso, é claro, depende da quantidade de sílica que você irá utilizar.

Figura 6. Rough Guide para a escolha do diâmetro da coluna.

Quanto Sílica eu preciso?

Quanto você precisa de sílica é determinada pelo quanto de seu exemplo que você tem que separar. A proporção de sílica para amostra não tem de ser exacta, mas deve estar na área da direita para evitar desperdício de tempo e de recursos. É também aconselhável para medir a sílica, em peso, em vez de volume à medida que a densidade de sílica pode variar dependendo do tipo.

O outro fator que afeta a quantidade de sílica necessário é quão fácil ou difícil a separação vai ser. Isto é determinado através da execução de TLC como parte do processo de escolha de um solvente (ver acima). 
O mais difícil a separação, a maior o peso de sílica em relação ao peso da amostra será. Boas orientações são dadas em Tab. 2.

Tabela 2. orientações para sílica para razão amostra dependendo da facilidade de separação a ser executada.

O que vem a seguir?

Depois de ter seu sistema de solvente escolhido para fora, saber o quanto você precisa de sílica, e de ter encontrado uma coluna de um tamanho adequado, você está pronto para começar a embalar sua coluna . Claro, cada coluna é único e nem todos irão dar resultados de TLC como os idealizados mostrados aqui. Na parte três, vamos olhar para algumas técnicas de fotografia de problemas para problemas comuns e alguns "rápido e sujo" Alternativas para executar uma coluna inteira.